Analyse des Genexpressionsmusters von synovialen Fibroblasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis mittels RAP-PCR Differential Display

Zusammenfassung

□ Fragestellung

Im rheumatischen Gelenk finden sich transformiert erscheinende Fibroblasten an der Invasionszone in den Knorpel und Knochen. Über die Faktoren, die zu diesem aggressiven Phänotyp führen, ist bisher wenig bekannt. Ziel der Untersuchungen war daher, mittels RAP-PCR (RNA arbitrarily primed PCR) zwischen rheumatoiden Fibroblasten und Osteoarthritis-Fibroblasten differentiell exprimierte Gene zu erfassen.

□ Methodik

Die Gesamt-RNS von synovialen Fibroblasten wurde im ersten Schritt der RAP-PCR mittels arbiträren Zehn- bis Zwölf-Basen-Primern in cDNS überschrieben. Die Amplifikation des zweiten Schrittes erfolgte dann ebenfalls mittels Zehn- bis Zwölf-Basen-Primern unter niedrigstringenten Bedingungen für insgesamt 35 Zyklen, gefolgt von elektrophoretischer Auftrennung, Klonierung und Sequenzanalyse der differentiell exprimierten RAP-PCR-Produkte.

□ Ergebnisse

Im Durchschnitt konnten je Primerpaar ca. 70 verschiedene RNS amplifiziert werden, wobei das Expressionsmuster der RA- und OA-Fibroblasten eine hohe Homologie aufwies. Insgesamt konnten aus den mit 26 verschiedenen Primerkombinationen durchgeführten RAP-PCR Differential Displays zwölf sehr stark differentiell exprimierte RNS nachgewiesen werden. Die Sequenzanalysen der hierbei in den rheumatoiden Fibroblasten hochregulierten und bisher identifizierten Gensegmenten zeigten sehr große Homologien zu verschiedenen in den Zellmetabolismus involvierten Gene.

□ Schlußfolgerung

Die Untersuchungen zeigen, daß in rheumatoiden synovialen Fibroblasten mittels RAP-PCR Differential Display spezifisch exprimierte Gene identifiziert werden können, die möglicherweise eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie dieser Erkrankung spielen.

Abstract

□ Objective

Destruction of articular cartilage and bone by invading synovial fibroblasts is a typical histopathologic feature in rheumatoid arthritis (RA). However, little is known about specific up- or downregulation of genes leading to this aggressive phenotype. Thus, our aim was to identify genes, which are differentially expressed in RA synovial fibroblasts as compared to synovial fibroblasts derived from patients with osteoarthritis (OA) using RAP-PCR for differential display.

□ Methods

After extraction of total RNA, the first step of RAP-PCR was performed using various different arbitrary 10–12-base primers for first-strand cDNA synthesis. Second-strand synthesis was achieved by cycling at low stringency conditions for 35 cycles using different arbitrary 10-base primers, followed by electrophoretic separation and sequence analysis of the amplified fingerprint products.

□ Results

On average, approximately 70 different RNAs were obtained per primer, of which most were expressed both by RA and OA synovial fibroblasts. Using 26 different primer combinations, in total 12 cDNAs were differentially expressed between RA and OA synovial fibroblasts. In the RA group strong amplification of distinct PCR products suitable for sequencing could be observed. Sequence analysis identified these PCR products as highly homologous to various genes involved in regulation of cell cycle and metabolism.

□ Conclusion

The data indicate that RAP-PCR is a suitable method to identify differentially expressed genes in rheumatoid synovial fibroblasts potentially involved in the specific pathophysiology of RA.