In vitro Transduktion humaner osteoblastärer Zellpopulationen mit retroviralen Vektoren

Zusammenfassung

Einleitung: Interleukin-1 ist ein wichtiger Faktor in der Pathophysiologie der Osteoporose und möglicherweise der periartikulären Knochenresorption bei rheumatoider Arthritis. Die Nutzung von therapeutischen Proteinen, wie Zytokinen und Wachstumsfaktoren als neue therapeutische Modalität beinhaltet ein großes medikamentöses Potential. Die konventionelle Applikation rekombinanter Proteine ist jedoch für eine klinischen Anwendung aufgrund kurzer Halbwertzeiten ungeeignet. Fragestellung: Es sollte erstens untersucht werden, ob humane osteoblastäre Zellen in vitro retroviral transduziert werden können. Zweitens wurde getestet, ob sich die retrovirale Transduktionsrate in vitro optimieren läßt. Methode: Die untersuchten Zellpopulationen wurden aus humanen Spongiosaproben isoliert und in vitro kultiviert. Das β-Galactosidase-Gen (LacZ) und die cDNA des humanen Interleukin-I-rezeptorantagonistischen Proteins (IL-1Ra) wurden durch retroviral vermittelten Gentransfer auf die Zellkulturen übertragen. Die LacZ Aktivität wurde durch Xgal-Färbung bestimmt, IL-1Ra wurde mittels ELISA quantitativ gemessen. Ergebnisse: Die IL-1Ra-Expression erreichte Werte von 8614pg IRAP/50000 Zellen/48h bis 10089pg IRAP/50000 Zellen/48h. Unter Optimierung der Transduktionstechnik ließ sich bei der X-gal-Färbung nach retroviralem Transfer des LacZ Gens eine Transduktionsrate von 60% nachweisen. Schlußfolgerungen: Unsere Ergebnisse demonstrieren, daß eine retrovirale Transduktion von humanen osteoblastären Zellen in vitro möglich ist und zu einer reproduzierbaren Produktion der transgenen Produkte führt.

Summary

Objectives: The involvement of cytokines in degeneration and inflammation of human tissue is well established. Interleukin-1 (IL-1) is a major agent in the pathophysiology of periarticular bone resorption in rheumatoid arthritis and in osteoporosis. Because the use of recombinant cytokines and growth factors is limited due to their short half lives, techniques are needed to get a permanent release of these therapeutic proteins. The rational of this study was to show that retroviral transduction of human osteoblastic cells is possible in vitro using the marker gene LacZ and the potentially therapeutic gene encoding for human interleukin-1 receptor antagonist protein (IL-1Ra). Different transduction techniques were combined to improve the rate of transduction in vitro. Methods: Osteoblastic cells were isolated from human spongious bone and cultured in vitro. The β-galactosidase (LacZ) gene and the cDNA of IL-1Ra were introduced into the isolated cells by retrovirus mediated gene transfer. LacZ activity was determined by Xgal staining, IL-1Ra was measured quantitatively by ELISA. Results: The transfer of retroviral IL-1Ra led to IL-1Ra expression of 8614 to 10089pg IRAP/50000 cells/48h. By combining different techniques to improve transduction, the X-gal staining established a rate of transduction of 60%. Conclusion: Our results demonstrate that retroviral transduction of human osteobalstic cells is possible in vitro, and leads to high levels of the synthesized transgene product. The rate of retroviral transduction can be accelerated in vitro.